שילוב אנליזה מורפולוגית וציטוגנטית משפרת מאד את רגישות וסגוליות איבחון תאי סרטן אפיתל המעבר בשתן- תוצאות נסיון ראשוני עם ™Duet מערכת לאנליזה אוטומטית מורפולוגית וציטוגנטית של חברת Bio View
מחברים: א. ליבוביץ'[1], מ. דניאלי[2], ר. רונה[3], ט. קפלן[2], ש. אולספנגר[3], ל. אלבוים[3], י. זילברשטיין[2], א. פרייברגר[2], ד. קידרון[4], ס. לב[3]
(1) מחלקה אורולוגית מרכז רפואי ספיר בית חולים מאיר , כפר סבא
(2) חברת BioView, רחובות, ישראל
(3) יחידה ציטולוגית, מחלקה פתולוגית, מרכז רפואי ספיר בית חולים מאיר, כפר סבא
(4) מחלקה פתולוגית, מרכז רפואי ספיר בית חולים מאיר, כפר סבא
תקציר
ציטולוגיה נחשבת כיום כסטנדרט לאיבחון תאי סרטן אפיתל המעבר
(TCC) בשתן. השיטה סובלת מרגישות נמוכה במיוחד בגידולים שטחיים בדרגת התמיינות גבוהה ותלויה מאד בבודק. לשיטות איבחון מולקולריות כגון BTA ו- NMP22 אמנם יש רגישות גבוהה יותר, בהשוואה לציטולוגיה סטנדרטית, אך הן לוקות בסגוליות נמוכה יותר. לאחרונה פורסמו עבודות שהראו כי איבחון ציטוגנטי של TCC בדגימות שתן בטכנולוגית
Fluorescence in situ Hybridization) FISH) מצטיין ברגישות וסגוליות גבוהים. הרעיון שמאחורי העבודה הנוכחית היה לשלב אנליזה מורפולוגית לזיהוי תאים חשודים בעזרת צביעה ציטולוגית סטנדרטית ולבדוק את אותם תאים לנוכחות שינויים ציטוגנטיים בשיטת ה- FISH.
האנליזה המשולבת בוצעה במערכת אוטומטית המאפשרת שתי סקירות רצופות של המשטח ( ™Duet, חברת BioView בע"מ www.bioview.co.il רחובות, ישראל). הסקירה הראשונה היא מורפולוגית ולאחריה התאים עוברים קישור לסמנים כרומוזומלים ספציפים בשיטת ה- FISH. הסקירה השניה בודקת את תוצאות ה FISH באותם תאים שזוהו כחשודים מורפולוגית.
במהלך העבודה נבדקו דגימות שתן של 37 חולים. 32/37 חולים הופנו לביופסיה ו/או Urethral Resection of Bladder Tumor) TURBT) בגלל ממצאים ציסטוסקופים. מהם, אצל 21 חולים (65.6%) נמצאה עדות בהיסטופתולוגיה ל- TCC. אנליזה משולבת זיהתה 21/21 חולים עם TCC (רגישות 100%) בעוד ציטולוגיה סטנדרטית זיהתה רק 13/21 מקרים (רגישות 61.9%). הבדל זה בין הרגישויות הוא בעל מובהקות סטטיסטית (P=0.0133). הסגוליות של האנליזה המשולבת (בחולים ללא היסטוריה של TCC וללא ממצאים ציסטוסקופים חשודים) היתה 100%.
תוצאות מחקר ראשוני זה מראות כי לאנליזה משולבת מורפולוגית וציטוגנטית רגישות וסגוליות מקסימלים באיבחון TCC בדגימות שתן. יתרון זה נשמר גם בגידולים בשלבים נמוכים ובדרגות נמוכות.
מבוא
סרטן אפיתל המעבר בשלפוחית השתן (TCC) הינו הרביעי בשכיחותו בגברים והשמיני בשכיחותו בנשים. גם לאחר טיפול והחלמה לכאורה, נזקקים חולי TCC למעקב מתמיד למניעת חזרתו של הגידול. המעקב כולל ציסטוסקופיות תקופתיות (המערבות לעיתים ביופסיות) בשילוב בדיקה ציטולוגית לנוכחות תאים סרטניים בנוזל השתן. הציסטוסקופיה הינה פולשנית וכרוכה בסבל וכאב לחולה בעוד הבדיקה הציטולוגית סובלת מרגישות נמוכה ותלויה מאוד בבודק. בדיקות נוספות כגון BTA-STAT ו- NMP-22 הוכיחו רגישות גבוהה יותר אולם הן לוקות בסגוליות נמוכה יותר.
סרטן אפיתל המעבר בשלפוחית השתן - כסרטנים רבים אחרים - מלווה בשינויים גנטיים רבים. השינויים הגנטיים המאפיינים סרטן זה הינם חסר בזרוע הקצרה של כרומוזום 9 באיזור בו ממופה הגן p16, ושינויים מספריים בכרומוזומים רבים כולל כרומוזום מס. 3, 7, 17, 11, 1 ואחרים. לאחרונה, פותחה שיטה חדישה למעקב אחרי TCC המבוססת על טכנולוגית ה –Fluorescence in situ Hybridization) FISH).
בשיטה זו, סט של סמנים פלואורסנטים כרומוזומלים ספציפים לכרומוזומים 3, 7, 17 ולגן Vysis, UroVysion) p16) עוברים קישור לתאים הנמצאים בנוזל השתן. המשטח כולו נצבע ב- DAPI - צביעת רקע המקובלת בשיטת ה- FISH. בתא תקין, יהיו שני עותקים מכל כרומוזום (שני סינגלים פלואורסנטים עבור כל כרומוזום). בתאים סרטניים, המספר התקין של הכרומוזומים יופר. על מנת ליעל את תהליך חיפוש התאים הסרטניים במשטח, מצמצמים את הבדיקה לתאים הנראים חשודים על פי המורפולוגיה שלהם: בעלי גרעין גדול ולא סדיר המדגימים אי-אחידות בצביעת ה- DAPI. שיטת ה- FISH הוכחה אמנם כיעילה למדי במעקב אחרי חולי TCC אולם דיוקה ורגישותה עדיין אינם טובים מספיק – בעיקר בגידולים בשלבים נמוכים ובדרגות נמוכות. הנחת העבודה היא שבחירת תאים לאנליזת FISH המסתמכת על המורפולוגיה שלהם כפי שמודגמת תחת צביעת ה- DAPI אינה מספקת.
בעבודה זו פיתחנו שיטה המשלבת אנליזה מורפולוגית ואנליזת FISH על אותו משטח על מנת להביא לרגישות וסגולויות גבוהות יותר במעקב אחרי חולי TCC. בעבודה נעשה שימוש במערכת סריקה חדישה
(™Duet), פרי פיתוח ישראלי של חברת BioView Ltd, המאפשרת שתי סריקות עוקבות של אותו משטח תחת שתי צביעות שונות. המיקום המדוייק של התאים המאותרים בסריקה הראשונה נשמר בזיכרון המחשב וניתן לחזור ולנתח אותם בסריקה השניה – הפעם, בצביעה שונה. הרעיון שמאחורי העבודה הנוכחית היה שהצלבת התוצאות בין הציטולוגיה והגנטיקה - זיהוי תאים חשודים בעזרת צביעה ציטולוגית סטנדרטית ובדיקת אותם תאים לנוכחות שינויים ציטוגנטיים בשיטת ה- FISH, יגביר את היכולת שלנו לזהות את חזרת הסרטן גם בגידולים בשלבים נמוכים ובדרגות נמוכות בהם גם לציטולוגיה הקלאסית וגם לשיטת ה- FISH אין מענה הולם.
מערכת ה- ™Duet מאפשרת סריקה אוטומטית של משטחי תאים בתאורת אור (Brightfield) ובתאורה פלואורסנטית. המערכת מורכבת ממיקרוסקופ אוטומטי (Axioplan2, Carl Zeiss, גרמניה), במה ממונעת המסוגלת להכיל עד 8 משטחי תאים בו זמנית ומצלמת 3CCD צבעונית. תוכנת המחשב שפותחה בחברת BioView מאפשרת שליטה ברכיבי המערכת וניתוח ומאגר של תוצאות הסריקות.
חולים ושיטות
בעבודה הנוכחית נבדקו 37 חולים עם חשד לTCC או חולים הנמצאים במעקב שיגרתי בגלל היסטוריה של TCC.
כל הדגימות עברו עיבוד שכלל:
דגימות שתן לציטולוגיה סטנדרטית ולאנליזה משולבת (מורפולוגיה ו- FISH), ציסטוסקופיה ולפי הממצאים, החולה הופנה לביצוע ביופסיות שלפוחית ו/או TURBT. שיטת ההכנה לאנליזה המשולבת כללה את הכנת המשטחים לבדיקה מורפולוגית על פי שיטות ציטולוגיות מקובלות, סריקת המשטחים באופן אוטומטי בעזרת מערכת ה- ™Duet וזיהוי תאים חשודים על פי קריטריונים מורפולוגים, שטיפת הצביעה המורפולוגית וסימון התאים בגלאי דנ"א פלואורסנטים בשיטת ה- FISH וסריקה אוטומטית נוספת תוך חזרה מדוייקת לאותם תאים חשודים שנמצאו לאחר הסריקה הראשונה.
בדיקות ה-FISH בוצעו עם שתי תערובות סמנים לכרומוזומים 3,7,17 (Qbiogene צרפת) וכרומוזומים 3,7,17 והגן Vysis, UroVysion) p16 ארה"ב). תא פתולוגי בבדיקת FISH נחשב תא עם תוספת של 2 כרומוזומים או יותר, או חסר בגן p16. בכל משטח הוגדרו 260-25 תאים חשודים מורפולוגית שנבדקו בסריקת ה- FISH לנוכחות שינויים כרומוזומיים. במשטחים בהם נמצאו 25> תאים חשודים מורפולוגית, סריקת ה- FISH נעשתה על 100 תאים שנבחרו באופן אקראי. דגימה חיובית ל- TCC הוגדרה כדגימה בה נמצא לפחות תא פתולוגי אחד על פי שני המדדים: מורפולוגיה ו- FISH. תוצאות האנליזה המשולבת הושוו לתוצאות הציטוטלוגיה, הציסטוסקופיה והביופסיה. האבחנה ההיסטופתולוגית שימשה כאמת מידה על פיה נקבעו שיעורי הרגישות והסגוליות של האנליזה המשולבת.
תוצאות:
מתוך 37 חולים, 32 הופנו לביופסיה ו/או TURBT בגלל ממצאים ציסטוסקופים. מהם, אצל 21 חולים (65.6%) נמצאה עדות בהיסטופתולוגיה ל- TCC. אנליזה משולבת זיהתה 21/21 חולים עם TCC (רגישות 100%) בעוד ציטולוגיה סטנדרטית זיהתה רק 13/21 מקרים ( רגישות 61.9%). הבדל זה בין הרגישויות הוא בעל מובהקות סטטיסטית (P=0.0133). הרגישות המירבית (100%) של האנליזה המשולבת בלטה במיוחד בגידולים הקשים ביותר לזיהוי ציטולוגי: בשלב TA (רגישות ציטולוגיה 27.3%) ובדרגה 1 (רגישות ציטולוגיה 30%) . הסגוליות של האנליזה המשולבת (בחולים ללא היסטוריה של TCC וללא ממצאים ציסטוסקופים חשודים) היתה 100%.
היתרון הגדול בשילוב ניתוח מורפולוגי עם FISH מודגם בתמונות A-D. בתמונה A ניתן לראות תא פתולוגי גם לפי קריטריונים ציטולוגים וגם לפי תבנית ה- FISH. תא זה היה מזוהה כלא תקין תחת כל אחת משיטות הבדיקה באופן נפרד.
בתמונה B ניתן לראות תא תקין מבחינה מורפולוגית. כאשר בוחנים אותו תחת צביעת ה- DAPI, הוא נראה חשוד: הגרעין גדול ולא סדיר. תבנית ה- FISH התקינה בשילוב המידע מהצביעה המורפולוגית נותנים יחד מידע משכנע מספיק על מנת להסיק שמדובר בתא תקין.
בתמונה C מצולם תא שלא נראה מאד חשוד בצביעת ה- DAPI שלו – הגרעין קטן וצבוע באופן אחיד. גם כאשר בוחנים תא זה על פי קריטריונים מורפולוגים המסקנה אינה חד משמעית. כאשר משלבים יחד את המידע מכל הצביעות השונות עם תבנית ה- FISH הלא תקינה, קל לנו יותר לקבוע שאכן מדובר בתא פתולוגי.
בתמונה D מופיע תא שהאבנורמליות שלו אינה מוטלת בספק. אולם במקרה זה, תא זה היה התא האבנורמלי היחידי שנמצא במשטח. כל אחת מהשיטות השונות בפני עצמה לא תאבחן דגימה זו כדגימה פתולוגית על סמך תא אחד בלבד. השילוב בין המורפולוגיה ל- FISH מעניק ביטחון באבחנה של כל תא ותא המאפשר לזהות דגימות פתולוגיות גם על סמך תא בודד. ואכן במקרה זה האבחנה של השיטה המשולבת אושרה בבדיקה היסטופתולוגית.
מסקנות:
תוצאות מחקר ראשוני זה מראות כי לאנליזה משולבת מורפולוגית וגנטית רגישות וסגוליות מקסימלים באיבחון TCC בדגימות שתן. יתרון זה נשמר גם בגידולים בשלבים נמוכים ובדרגות נמוכות. השילוב בין שתי השיטות הביא לביטחון רב באבחנה ואיפשר לזהות נכונה גם דגימות בהן מספר התאים הפתולוגים היה נמוך יחסית. פרוטוקול ההכנה הפשוט יחסית בשילוב יכולות האוטומציה של מערכת ה-
™Duet יאפשרו ליישם שיטה זו במרבית המרכזים הרפואיים. לאור היתרון הבולט של השיטה בגידולים בשלבים נמוכים ובדרגות נמוכות, יהיה מוצדק במיוחד ליישם את השיטה בקבוצה זו. מחקר בעל היקף רחב יותר ידרש על מנת לקבוע את גבולות הביטחון של השיטה ועל מנת לבדוק האם ביכולתה להוות תחליף למשטר המעקב הנהוג כיום.